Resumen

Los análisis moleculares de las cepas de M. tuberculosis que presentan una resistencia a rifampicina (RIF), han demostrado que la mayoría de estas cepas presentan mutaciones dentro de una región específica de 81 bp dentro del gen rpoB.

Diferentes tipos de ensayos moleculares tales como, secuenciación de DNA, análisis heterodúplex, análisis por polimorfismos de cadena sencilla, análisis por electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante(DGGE), entre otros; han sido desarrollados por laboratorios e investigadores para poder realizar una detección rápida de la resistencia a RIF. Sin embargo, en México la mayoría de los laboratorios sigue empleando metodologías basadas en caracterizaciones fenotípicas que pueden llevar al menos entre 6 y 8 semanas.

En este trabajo se adaptó una metodología para lograr una detección rápida de mutaciones asociadas con resistencia a RIF; por medio de una amplificación semianidada de la región de 81 bp del gen rpoB y el análisis por medio de Geles DGGE.

Para la amplificación de esta región, se seleccionaron los oligonucleótidos diseñados por Whelen et al. 1995. Se lograron amplificaciones positivas a partir de concentraciones de DNA de 102 copias/ l y en 7/13 cepas de M. tuberculosis. Para poder realizar los análisis por DGGE, un oligo fue modificado al añadirle un dominio de psoraleno para evitar la separación total de las cadenas de DNA dentro del gel DGGE. Las muestras con amplificaciones positivas, fueron irradiadas con luz UV a una longitud de onda de 365 nm para inducir la unión del psoraleno a las cadenas de DNA. Una vez irradiadas las muestras, estas fueron analizadas por medio del gel DGGE. Se logró la detección de 3 cepas mutantes de un total de 7 analizadas. Sin embargo, debido a la poca cantidad de cepas analizadas; así como la falta de análisis fenotípicos de resistencia a RIF y de secuenciación de las cepas en las que se encontraron mutaciones, dificulta la corroboración de los resultados y por consiguiente no permite el establecimiento de una técnica para la detección rápida de mutaciones dentro del gen rpoB de M. tuberculosis. De cualquier forma, los resultados aquí obtenidos sientan las bases para que en trabajos posteriores se logre el montaje de una técnica molecular que permita una detección fácil y rápida de mutaciones dentro de la región de 81 bp del gen rpoB de M. tuberculosis.

Índice de contenido

Capítulo 1. Índice (archivo pdf, 27 kb)

Capítulo 2. Abreviaciones (archivo pdf, 22 kb)

Capítulo 3. Resumen (archivo pdf, 33 kb)

Capítulo 4. Introducción (archivo pdf, 28 kb)

Capítulo 5. Antecedentes (archivo pdf, 66 kb)

Capítulo 6. Justificación (archivo pdf, 26 kb)

Capítulo 7. Objetivos (archivo pdf, 30 kb)

Capítulo 8. Materiales y Métodos (archivo pdf, 430 kb)

Capítulo 9. Resultados (archivo pdf, 256 kb)

Capítulo 10. Discusión (archivo pdf, 39 kb)

Capítulo 11. Conclusiones (archivo pdf, 35 kb)

Referencias (archivo pdf, 82 kb)

Apéndice A. Soluciones (archivo pdf, 51 kb)

Apéndice B. Colorantes y reveladores (archivo pdf, 52 kb)

Apéndice C. Gel poliacrilamida (archivo pdf, 52 kb)

Apéndice D. Gel DGGE (archivo pdf, 54 kb)

Apéndice E. Secuencia completa del gen rpoB (archivo pdf, 53 kb)

Apéndice F. Regiones amplificadas por grupos de oligonucleótidos (archivo pdf, 54 kb)

Apéndice G. Tabla de mutaciones reportadas en el gen rpoB (archivo pdf, 63 kb)

Apéndice H. Mapas de separación de DNA de los oligos (archivo pdf, 478 kb)

Apéndice I. Estructura molecular del psoraleno y su unión a la cadena de DNA (archivo pdf, 70 kb)

Puga González, I. 2005. Detección de mutaciones en el gen rpoB relacionadas con resistencia a Rifampicina en cepas de Mycobacterium tuberculosis del estado de Puebla. Tesis Licenciatura. Biología con área en Biotecnología. Departamento de Química y Biología, Escuela de Ciencias, Universidad de las Américas Puebla. Marzo. Derechos Reservados © 2005.